Liczba wyświetleń:0 Autor:Edytuj tę stronę Wysłany: 2021-11-24 Źródło:Ta strona
Jeśli jest to ilościowa PCR z fluorescencją w czasie rzeczywistym do ilościowego oznaczania wirusa i genotypowania SNP, potrzebujemy maszyny do PCR o najwyższej możliwej specyficzności; jeśli jest to wykrywanie patogenów i mRNA, potrzebujemy dużej czułości Maszyna do PCR, więc jak powinniśmy zoptymalizować tę maszynę PCR?
Oto lista treści:
l Poprawa wydajności amplifikacji maszyny PCR
l Używanie starterów maszynowych do PCR w czasie rzeczywistym do ogólnego PCR
Aby poprawić maszynę PCR wydajność, specyficzność i czułość amplifikacji, możemy zoptymalizować maszynę do ilościowego PCR z fluorescencją w czasie rzeczywistym na potrzeby eksperymentu za pomocą szeregu pomiarów. Pierwszym z nich jest wybór sekwencji docelowej.
1, wybór wygodnej sekwencji docelowej maszyny PCR w czasie rzeczywistym o odpowiedniej długości od 50 do 150 pz. Krótsze sekwencje wymagają mniej czasu na syntezę i mają krótszy czas amplifikacji, więc ryzyko zanieczyszczenia amplifikowanego DNA jest zmniejszone.
2. Wybierając sekwencję docelową, użyj wyszukiwania BLAST, aby przeanalizować sekwencję docelową pod kątem polimorfizmów i błędów sekwencjonowania i uniknąć ich. Jeśli w sekwencji docelowej znajdują się zduplikowane sekwencje, zmniejszy to czułość wykrywania tej maszyny do PCR, czego również należy unikać.
3, kontrolować zawartość GC ≤ 60% w sekwencji docelowej. Wysoka zawartość GC wpłynie na denaturację sekwencji docelowej w cyklu termicznym, ale także będzie łatwa do wytworzenia niespecyficznej amplifikacji w tej maszynie PCR.
4, unikaj generowania struktury wtórnej. Sekwencje docelowe z sekwencjami odwrotnymi, powtarzalnymi są łatwe do wytworzenia struktury drugorzędowej, co wpływa na hybrydyzację wygodnych starterów i sond do maszyny PCR w czasie rzeczywistym.
Oprócz tego musimy również upewnić się, że jakość matrycy nie wpłynie na amplifikację, a wyniki wygodnej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym są wiarygodne. Na przykład uszkodzonego DNA nie można odpowiednio amplifikować w urządzeniu PCR lub nie można go w ogóle amplifikować. Ponadto obecność w matrycy odczynników hamujących polimerazę DNA (DMSO itp.) i zanieczyszczeń (SDS itp.) może wpływać na wiarygodność wyników amplifikacji maszynowej PCR.
Uzyskaj wygodę w czasie rzeczywistym Maszyna do PCR starterów, metodę tę można również zastosować do zwykłej reakcji PCR.
1. Długość powinna wynosić 18-30 bp, aby zapewnić specyficzność wiązania.
2. Temperatura topnienia (wartość Tm) powinna wynosić 55-60°C, a wartości Tm obu podkładów powinny różnić się o 2-3°C.
3, Każdy starter powinien zawierać 1 do 3 guaniny lub cytozyny na końcu 3', co może dogodnie zredukować nieswoistą amplifikację podczas maszyny PCR w czasie rzeczywistym. Więcej niż 3 spowoduje odwrotny skutek i spowoduje „efekt poślizgu”, prowadzący do nieprawidłowego przedłużenia.
4. Zawartość GC w starterach powinna wynosić około 50%, zbyt duża zawartość GC spowoduje wzrost wartości Tm.
5, startery maszyny PCR powinny unikać odwrotnych, powtarzalnych sekwencji, ponieważ utworzą one strukturę drugorzędową, wpływającą na wiązanie startera na matrycy.
6. Jeśli jest to RT-PCR, należy również unikać projektowania starterów wiążących się z sekwencjami eksonów, co doprowadzi do fałszywie dodatnich wyników eksperymentalnych maszyny PCR. Prawidłowe podejście należy zaprojektować na długim boku intronu lub na krótkich intronach lub w poprzek obszaru połączenia ekson-ekson.
7. Odsalanie i oczyszczanie podkładów.
Należy pamiętać, że czasami, po wykonaniu wszystkich punktów, startery mogą nie zostać wzmocnione, dlatego należy je przeprojektować.
Koncentrując się na szybkim wykrywaniu kwasów nukleinowych i szybkim wykrywaniu POCT, Bioteke oferuje różnego rodzaju instrumenty laboratoryjne, takie jak: pobieranie próbek wirusów, automatyczny ekstraktor kwasów nukleinowych, maszyna do PCR i aparatura dezynfekcyjna. Zapewnia także wiele rodzajów odczynników i zestawów.
